Banebrytende om signaloverføring mellom nerveceller

Espen Hartveit Foto: Jan Reidar Lothe

Denne forståelsen kan være av avgjørende betydning for å forstå sykdoms-mekanismer og forbedre behandlingsopplegg og terapier relatert til nevrologiske sykdommer og forstyrrelser.

Hartveit og medarbeiderne i laboratoriet hans bruker en multidisiplinær tilnærming for å få svar på basale spørsmål i nevrobiologi. Dette er spørsmål som fokuserer på hvordan nerveceller kommuniserer med hverandre og hvordan informasjon kan behandles av og formidles mellom celler i nervesystemet.

I det eksperimentelle arbeidet bruker de elektrofysiologisk registrering ved hjelp av "patch clamp" teknikken der de kan registrere elektriske signaler i nervecellene. Slike signaler oppstår i form av elektrisk strøm gjennom ørsmå porer, kalt ionekanaler og som utgjøres av bestemte proteiner, i membranen til cellene.

I tillegg kombinerer de slik elektrofysiologisk registrering med billeddannende teknikker som multifoton-mikroskopi og computersimulering av ionekanaler, nerveceller og enkle nettverk av nerveceller. Uten en dyp og bredest mulig forståelse av de molekylære, cellulære og biofysiske mekanismene som ligger til grunn for signaloverføring og signalbearbeiding i nervesystemet, er det vanskelig å tenke seg at vi noensinne vil etablere et solid grunnlag for å utvikle adekvate behandlingsmetoder for pasienter med spesifikke nevrologiske lidelser.

Enkelte fysiologiske mekanismer i menneskekroppen, spesielt i nervesystemet, er så kompliserte at det krever både stor tålmodighet, mange års dybdeforskning, avansert teknologi og stor fagkompetanse for å måle og forstå dem.  Forskningsfeltet til professor Espen Hartveit og medarbeiderne hans er av en slik karakter og betydelig innsats over lang tid har medført at de nylig greide å svare på en 20 år gammel utfordring fra Erwin Neher, formulert i et foredrag som Neher holdt i 1991 da han mottok Nobelprisen i fysiologi eller medisin sammen med sin kollega Bert Sakmann.

Vi spurte Hartveit hva denne utfordringen var, men aller først, hva slags forskning dette er, og hva som har drevet ham og fasinert ham ved den, og nå gitt dette gjennombruddet?

- La oss starte med utgangspunktet, grunnlaget for signaloverføringen mellom nerveceller. Den viktigste måten dette skjer på er i de såkalte kjemiske synapsene som er spesialiserte kontakter mellom nerveceller. Signalstoffene ligger pakket i små membranblærer, kalt vesikler, og kan frigjøres fra en gitt nervecelle ved at membranen i en vesikkel smelter sammen med, dvs. fusjonerer med, membranen som omgir nervecellen. Signalstoffet i en slik vesikkel vil da være frigjort fra cellen og kan diffundere over til den andre cellen, binde seg til reseptorer i cellemembranen og starte en respons i form av elektrisk strøm gjennom ionekanalene her. Patch-clamp teknikken er uovertruffen til å måle effekten av slike signalstoffer ved hjelp av elektrofysiologisk registrering. Problemet med nerveceller er at de har så tynne utløpere, gjerne bare noen få tusendels millimeter i diameter, og det er fra slike utløpere frigjøringen av signalstoffer gjerne skjer. Neher og hans medarbeidere hadde imidlertid flere år tidligere utviklet en elektrofysiologisk teknikk for å måle slike fusjoner av vesikler med cellemembranen og brukte denne på helt andre celletyper uten utløpere.

Vi spurte også Hartveit hva som er grunnlaget for denne teknikken og her må det fagterminologi til for å forklare.

- Neher innså at hver gang membranen i en vesikkel smelter sammen med cellemembranen, vil overflaten til cellemembranen øke tilsvarende. En cellemembran leder i seg selv ikke elektrisk strøm, men er omgitt av saltløsning både på innsiden og utsiden av cellen. Dette gjør at den vil opptre som en kondensator med samme type egenskaper et slikt kretselement har i elektrisitetslæren generelt. Ved å stimulere cellen på en bestemt måte kan vi måle størrelsen på kapasitansen og dette vil være et mål på membranoverflaten. Hver gang en vesikkel smelter sammen med cellemembranen, vil den elektriske kapasitansen øke litt.

Ok, men hva var det Nehers utfordring egentlig besto i?

- Neher formulerte det slik: "Unfortunately, nerve terminals are usually not accessible to the kind of biophysical investigations described here" og han tenkte da på kapasitansmålinger i runde celler. Det er to aspekter ved dette problemet. For det første er nerveterminalene så små, slik jeg allerede nevnte innledningsvis. For det andre var teknikken til Neher basert på at cellene kapasitansmålingene ble gjort på var runde celler uten utløpere siden dette forenkler den elektriske analysen. Dette i motsetning til nerveceller som kan ha en rekke tynne utløpere med nokså komplisert geometri. Takket være usedvanlig dyktige medarbeidere i laboratoriet, klarte vi å finne løsninger på disse utfordringene. For det første klarte Svein Harald Mørkve, mens han var doktorgradsstipendiat, å få til patch clamp registreringer direkte fra utløpere på en bestemt type celler i øyets netthinne. Disse cellene har litt større oppsvulminger på endene av utløpere enn det mange andre typer av nerveceller har. Utløperne er fortsatt små, men store nok til at vi akkurat klarte å få kontakt med spissen på de tynne glasselektrodene vi bruker til de elektriske registreringene. Alt dette gjøres under et spesialkonstruert mikroskop. For det andre utviklet Leif Oltedal, som en del av sitt doktorgradsarbeide, en computermodell, basert på detaljerte fysiologiske og anatomiske målinger av cellene i netthinnen. Denne computermodellen kunne han i neste omgang bruke til å analysere den spesielle situasjonen med kapasitansmålinger på de aktuelle nervecellenes utløpere slik at vi kunne ta høyde for og justere måten vi stimulerte cellene på i forsøkene våre. På denne måten kunne vi bestemme viktige funksjonelle egenskaper i de aktuelle nervecellene, f.eks. med hvilken hastighet vesikler med signalstoff kan frigjøres.

Klarer man med denne teknikken å måle hva som skjer når én enkelt vesikkel med signalstoff frigjøres?

- Nei, med dagens teknikk er ikke det mulig. Størrelsen på membranoverflaten i én enkelt vesikkel er ikke stor nok og responsen drukner i bakgrunnsstøyen. Det er ørsmå responser vi måler. Som et eksempel kan jeg nevne hva som skjer når man plutselig stimulerer en nervecelle til å frigjøre vesikler med signalstoff. Det viser seg at en gruppe vesikler nærmest står på rekke og rad like inntil cellemembranen og er klar til å fusjonere så snart signalet kommer. Tilsammen øker disse vesiklene membraneoverflaten med ca. 10 femtoFarad (Farad er måleenheten for kapasitans, oppkalt etter den britiske fysikeren Michael Faraday). Én femtoFarad er 10^-15 Farad, dvs. en tusendel av en billiondels Farad, så det er snakk om ekstremt følsom apparatur som kreves for slike målinger.

Tenker du mye på hva resultatene av forskningen din kan brukes til, lidelser som skal kureres, etc., eller er det ren nysgjerrighet i forhold til å avdekke og forklare basale fysiologiske mekanismer som er drivkraften i ditt forskningsvirke?

- I utgangspunktet er nok drivkraften, for meg som for mange andre forskere, primært nysgjerrighet. Det kreves både nysgjerrighet, stå-på-vilje og klare mål for å fravriste naturen dens hemmeligheter. Det er viktig å huske på at resultatene ikke kommer av seg selv. I store deler av det vi gjør, arbeider vi på helt på grensen av det som er fysisk og praktisk mulig. Ofte har vi langt flere mislykkede enn vellykkede forsøk, i likhet med mange andre forskere. Samtidig er det klart at det er en tilfredsstillelse å vite at forskningen kan komme direkte til nytte for andre mennesker. Om ikke i et kortsiktig perspektiv, så i det minste i et langsiktig perspektiv. Vi må også huske på at kunnskap som i dag tas for gitt og oppfattes som en selvsagt del av den etablerte kunnskapsbasen, en gang var i forskningsfronten og sikkert kunne virke nokså esoterisk i sin samtid. Det blir fra enkelte hold hevdet at stort sett det meste av fundamentale oppdagelser innen biomedisin allerede er gjort. For mitt vedkommende, som nevrobiolog, kan jeg bare si at dette er så langt fra sannheten det er mulig å komme. Vår kunnskap om nervesystemet er så fragmentert og full av store hull på viktige felt at vi selv i dag bare skraper i overflaten av det som ligger og venter på oss og som vi ønsker å vite noe om. Det er liten tvil om at klassisk grunnforskning er under et betydelig press i dag, med økende krav om kortsiktig nytteverdi. Selv liker jeg å snu på problemstillingen og stille det omvendte spørsmålet: hvis ikke vi ved universitetene skal drive med grunnforskning, hvem skal da gjøre det?

Er det bestemte nevrologiske lidelser en kan tenke seg at denne forskningen kan bidra til behandlingen av?

- Kanskje ikke for den forskningen vi har diskutert her. Lignende forskning blir imidlertid utført på et par andre områder i hjerne der man også finner nerveceller med utløpere som er litt tykkere enn vanlig. Forstyrret signaloverføring mellom nerveceller er i høyeste grad relevant for å forstå en rekke lidelser, både innen nevrologi og psykiatri, og dette er et svært aktiv forskningsfelt. For vår egen forskning som utføres på nerveceller i øyets netthinne, er det kanskje større sjanse for at den kan få betydning for bestemte øyesykdommer som affiserer vår evne til mørkesyn.

Har dere allerede publisert disse resultatene?

- Ja, de ble nylig publisert i The Journal of Physiology (1). Artikkelen vår ble gitt ekstra oppmerksomhet i form av redaksjonell omtale i en Perspectives artikkel (2) som spesielt fremhevet "den omhyggelige og grundige analysen utført av Oltedal & Hartveit" som "har skaffet oss et detaljert veikart for fremtidige målinger av membrankapasitans i nerveterminaler med enda mer kompliserte morfologier". Dette syntes vi selvsagt var ekstra hyggelig.

Hva blir evt. neste skritt i fortsettelsen av denne forskningen?

- Det er klart at det vi så langt har gjort bare er en begynnelse, men videre fremgang vil være avhengig av en ny generasjon medarbeidere som tør å gi seg i kast med den type elektrofysiologiske forsøk som her kreves. Det er nødvendig med stor tålmodighet og vilje til langvarig øving for å få det til, men det er samtidig imponerede hvor raskt f.eks. Mørkve og Oltedal kom inn i feltet og lærte seg de aktuelle teknikkene slik at de ble i stand til å produsere original forskning på relativt kort tid. Nysgjerrige og motiverte medarbeidere er alltid velkommen i laboratoriet!

Lenke til artikkel i Journal of Physiology.

Lenke til Perspectives artikkel i Journal of Physiology.

Lenke til Hartveits lab., Nevrovitenskapelig forskningsgruppe, Institutt for biomedisin

Referanser:

1. Oltedal, L. & Hartveit, E. (2010) Transient release kinetics of rod bipolar cells revealed by capacitance measurement of exocytosis from axon terminals in rat retinal slices. Journal of Physiology, 588:1469-1487.

2. Kim, M.-H. & von Gersdorff, H. (2010) Extending the realm of membrane capacitance measurements to nerve terminals with complex morphologies. Perspectives, Journal of Physiology, 588:2011-12.

Computerbaserte rekonstruksjoner av nerveceller fra øyets netthinne. Cellene ble fylt med et fluorescerende fargestoff og visualisert med multifotonmikroskopi (Margaret Veruki og Espen Hartveit, upubliserte data)