Ina Blindheim Johansen

Introduksjon

Kjernereseptorer er en familie av ligandaktiverte transkripsjonsfaktorer som regulerer uttrykket av gen involvert i både utvikling, metabolisme og homeostase. Ligandene kan være endogene stoff som steroidhormoner, gallesyre, retinoider, tyroidhormoner eller vitaminer, men også eksogene kjemikalier som legemidler og miljøgifter. Vitamin D reseptoren (VDR) er en kjernereseptor i gruppen NR1I sammen med promiskuøs xenobiotika reseptor (PXR) og konstitutiv androstan reseptor (CAR). En av VDRs viktigste ligander er vitamin D₃, men reseptoren aktiveres også av blant annet sekundære gallesyrer (Berg, 1989; Klug and Schwabe, 1995). Hormonet, Vitamin D, spiller en viktig rolle med tanke på kalsium- og fosfathomeostasen, da det regulerer opptak av transcellulært kalsiumopptak samt  transporten av cystolisk kalsium (Bronner 2009). Blant teleoster har det vist seg at japansk flyndre (Paralichthys olivaceus) har fått identifisert to VDR (Suzuki 2008). Et av målgenene til VDR er CYP24A1, et av genene i cytokrom P450 superfamilien som koder for 25- hydroxyvitamin D₃-24-hydroxylase enzymet. PXR regulerer transkripsjon av gen, blant annet CYP3A4, som er viktige for metabolismen og eliminasjonen av stoffer (Reschly et al 2007). I studier av PXR i mammalske organismer som mennesket (Homo sapiens), hund (Canis lupus familiaris) og gris (Sus scrofa)  viser det seg at et bredt spekter av ligander kan aktivere reseptoren, mens kylling (Gallus gallus) og sebrafrisk (Danio rerio) synes å ha mindre liganddiversitet (Ekins et al 2008). Genomet til atlantisk torsk (Gadus morhua) ble sekvensert i 2011 (Star B, et al 2011). Preliminære bioinformatiske undersøkelser av torskegenomet identifiserer to VDR paraloger, men ingen PXR. Da PXR er fraværende vil man finne ut som signalveien med VDR og CYP24A1 har en større rolle i biotransformasjon hos torsk enn i andre vertebrater hvor PXR er tilstede.

CYP24A1 har en viktig spesifikk rolle i vitamin D-metabolismen som består av en femtrinns oksidasjonsvei fra 1α,25-(OH)₂D₃ til kalsitriolsyre, i tillegg til å katalysere en liknende metabolismevei som starter med 23- hydroksylering og 1α,23S,25-(OH)₂D₃26,23S-lakton. CYP24A1 vil kunne omdanne  1α,25-(OH)₂D₃ til 1α,23S,25-(OH)₂D₃ 26,23S-lakton eller kalsitriolsyre avhengig om CYP24A1 virker inn på karbon 23 eller 24 (Masud 2006, Uruhino 2009). Studier viser at CYP24A1 er uttrykt i mange ulike typer vev som nyre, lever og ben, og at uttrykket kan bli sterkt indusert av vitamin D reseptor-agonister (Masud 2006, Uruhino 2009). Dette kan vise at rollen til CYP24A1 primært er å begrense aktiveringen av 1,25-(OH)₂D₃ i målcellene.

Hos mennesker har man sett sammenheng mellom vitamin D-signalisering gjennom CYP24A1 og ulike typer metabolske sykdommer som bensykdommer, kroniske leversykdommer og ulike typer kreft (Petkovich et al 2011). Med økt forståelse av hvordan CYP24A1 virker hos atlantisk torsk vil man kunne utvide kunnskapen om giftstoffers metabolisme (Petkovich et al 2011).

Atlantisk torsk (Gadus morhua) befinner seg i nordlig del av Atlanterhavet, som strekker seg fra Canada til Norge. Arten finnes utenfor den norske kysten og blir ansett som en  lokal art med god tilgjengelighet. Eksport av torsk og laks er en viktig inntektskilde for den norske staten med stor økonomiske betydning samtidig som den er viktig for sysselsetting av arbeidere (Regjeringen.no, 2012).

Mål for masterprosjektet

Det overordnede målet er å karakterisere CYP24A1 fra torsk nærmere, gjennom:

• Kartlegge genuttrykking i ulike vev hos torsk vha Q-PCR
• Proteinuttrykking og aktivitetsstudier
• Bioinformatiske undersøkelser for å finne bindingsseter i promoter regionen, samt studere effekter av mulige mutasjoner på sekundær- og tertiærstrukturen.
• Undersøke hvordan mutasjoner i CYP24A1-genet vil kunne påvirke enzymaktivitet og substratspesifisitet.
• Kartlegge CYP24A1-ekspresjon i prøver fra torsk eksponert for ulike typer miljøgifter vha Q-PCR og western blotting.

Metoder

Først ønsker jeg å rense RNA fra torskelever slik at jeg får syntetisert cDNA, og deretter amplifisere CYP24A1 ved bruk av primere som har bestemte restriksjonsseter. Videre vil CYP24A1 ligeres i ekspresjonsvekttoren pTEM41 for å uttrykke proteinet i E.coli celler. Aktiviteten til metabolittene dannet av CYP24A1 med ulike substrater kan måles ved å bruke kromatografi og aktivitetsassay  (Feo M. L et al 2012).

Ved å bruke Q-PCR med SYBR green, fluoresens tag, kan jeg detektere mengden CYP24A1 amplifisert. CYP24A1 konsentrasjonen kan estimeres ved å sammenlikne CYP24A1 mot housekeeping gen (Ayra M, et al 2005). Jeg ønsker å  bruke epitop- analyse av CYP24A1 for å produsere eller evt. bestille et antistoff til bruk i blant annet Western blot.

Referanser

Arya M, Shergill S. I, Williamson M,  Gommersall L, Ayra N, Patel R. H. H. (2009) Basic principles of real- time quantitative PCR. Expert. Rew. Mol. Diagn. 5 (2), 209- 219

Berg, J.M. (1989). DNA binding specific of steriod receptors. Cell 57, 1065-1068

Bronne, F. (2009). Recent developments in intestinal calcium absorpton. Nutr. Rev., &7, 109-113.

Ekins S, Rechly E, Hagey J, Krasowki M. D. (2008). Evolution of pharmacologic specificity in the pregnane receptor PXR, BMC Evol., Biol 8. 103

Feo M. L, Gross M. S , McGarrigle B. P, Eljarrat E., Barcelo D. ,Aga D. S, Olson J. R (2012). Biotransformation of BDE-47 to Potentially Toxic Metabolites Is Predominantly Mediated by Human CYP2B6. http://dx.doi.org/10.1289/ehp.1205446 Online 18 (09.02.2012)Masud. S,

Strunell, S., Knutson. J.C, St-Arnaud. R, Jones. G (2006), Evidence for the activation of 1α-hydroxyvitamin D2 by 25-hydroxyvitamin D-24-hydroxylase: delineation of pathways involving 1α,24-dihydroxyvitamin D2 and 1α,25-dihydroxyvitamin D2.Biochim. Biophy. Acta 1761, 221-234. [PMID: 16516540]

Petkovich. M. P, Helvig. C, Epps. T, CYP24A1 regulation in health and disease, in: Feldman. D, Pike J.W, Adams. M, Vitamin D, thrid ed., Academic Press, 2011, pp. 1525- 1554 (Ch. 80)

Petkovich. M. P., Jones. G. (2011),  CYP24A1 and kidney disease. Current Nephrology & Hypertension. Volum 20, 337-344

Reschley. E,  Krasowski. J, Current (2006), Drug Metabolism (7), 349-65.

Regjeringen.no (2012) Fiske, fangst og fiskeoppdrett
http://www.regjeringen.no/nb/dep/nhd/tema/norsk-naringsliv/fiske-fangst-og-fiskeoppdrett-.html?id=481757 (09.02.2013)

Star B, Nederbragt J.A , Jentoft S et al. (2011) The genome sequence of Atlantic cod reveals a unique immune system. Nature. Volume 477, 207-210

Suzuki. T, Suzuki. N, Srivastava. A.S, Kurokawa. T, (2000). Identification of cDNA encoding two subtypes of vitamin D receptor in Flounder, Paralichthys olivaceus. Biochem. Biophys Res. Commun. 270 (2008) 40- 45..

Uruhino. N, Yasuda. K, Ikushiro. S, Kamakura. M, Otha. M, Skakai. T, (2009), Metabolism of 1alpha,25-dihydroxyvitamin D2 by human CYP24A1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 384, 144-148. PMID:19393625

Veileder: Anders Goksøyr

Medveileder: Marta Eide, Odd André Karlsen og Roger Lille- Langøy